Revistas / NPunto Volumen II. Número 14. Mayo 2019 / DONACIÓN Y TRASPLANTE DE ANEJOS FETALES

Alba María Albuerne Canal.

Graduada en Enfermería por la Universidad de Oviedo.

Enfermera Especialista en Enfermería Obstétrico-Ginecológica (Matrona) por la Unidad docente de Matronas del País Vasco.

DONATION AND TRANSPLANTATION OF FETAL ATTACHMENTS

1. ORIGEN EMBRIOLÓGICO DE LOS ANEJOS FETALES.

• Membranas

El desarrollo de la placenta y las membranas comienza con la implantación del blastocisto, compuesto por una masa de células interna, la cavidad blastocística y una masa de células externa (que se diferenciará en dos capas: el citotrofoblasto o capa interna y sincitiotrofoblasto o capa externa). Posteriormente, la masa celular interna se divide en dos capas: el epiblasto o ectodermo embrionario y el hipoblasto o endodermo extraembrionario.

A partir del epiblasto o ectodermo embrionario se origina el epitelio amniótico, de forma que las células del epiblasto proliferan y se reordenan permitiendo la aparición de la cavidad pro-amniótica. Posteriormente se produce un incremento del número de células, adquiriendo forma cuboide en la zona que se encuentra en contacto con el citotrofoblasto y cilíndrica en contacto con el hipoblasto. La cavidad aumenta de tamaño y se forma la cavidad amniótica definitiva. De esta forma, las células ectodérmicas que miran hacia el citotrofoblasto contituyen el epitelio amniótico. En contacto con estas células ectodérmicas se encuentran células mesodérmicas, aunque no se conoce cuál es el origen de estas. Las células mesodérmicas dan lugar al mesodermo amniótico y coriónico, en cuyo lecho se encuentran las células estromales o mesenquimales^1,2.

• Cordón umbilical y vasos sanguíneos

El embrión se encuentra unido al citotrofoblasto por medio del pedículo de fijación, cuyo origen es el mesodermo. A su vez, el saco vitelino emite una prolongación hacia el pedículo de fijación denominada alantoides, de origen endodérmico, que se embebe en su interior. Posteriormente comienzan a desarrollarse los vasos sanguíneos en el espesor del alantoides, lo que dará lugar a los futuros vasos sanguíneos fetales. Con el plegamiento embrionario, el pedículo de fijación que inicialmente se ubicaba en el extremo caudal se desplaza a la posición ventral, quedando posterior al pedículo del saco vitelino. Posteriormente estas estructuras se fusionan para dar lugar al cordón umbilical. El amnios constituirá la cubierta externa del cordón umbilical, en el que quedan incluidos el saco vitelino y el alantoides³.

Hay dos teorías que tratan de explicar la presencia de células madre mesenquimales en el cordón umbilical: una de ellas propone que su presencia se debe a las migraciones celulares de estas que tiene lugar durante el desarrollo fetal, momento en el que algunas células se quedarían atrapadas en el cordón umbilical. Otra teoría propone que estas células tienen origen en el mesénquima que da lugar a la matriz del cordón umbilica^1,4.

2. HISTOLOGÍA Y ANATOMÍA DE LOS ANEJOS FETALES MADUROS

• Membranas

La membrana amniótica es un tejido delgado, semitransparente que carece de vasos sanguíneos y que posee dos caras: una estromal (adherente) y otra epitelial. Histológicamente distinguimos en ella 3 capas ^1,5,6,7,8:

• Capa epitelial: Está constituida por células epiteliales de estructura cuboidal salvo en la zona que se encuentra sobre la placenta, en la que las células tienen una morfología columnar. En la superficie de estas células nos encontramos las microvellosidaes y en la zona basal encontramos que las células epiteliales emiten prolongaciones para anclarse firmemente a la membrana basal.
• Membrana basal: Se trata de una capa que está compuesta por sustancia amorfa y fibras reticulares, entre las que se encuentran la fibronectina y colágeno, sustancias necesarias para que tenga lugar la migración, proliferación, diferenciación y adhesión celular.
• Estroma: Dividido a su vez en 3 zonas. La lámina compacta está inmediatamente por debajo de la membrana basal, constituída por fibras, carece de células. A continuación encontramos un estrato de fibroblastos y por debajo encontramos la lámina esponjosa en contacto con el corion, rica en una matriz de mucina, hialuronato, fibronectina y colágeno
• Matriz extracelular: En ella encontramos proteoglicanos, glucosamínglucanos que dotan a la membrana de soporte mecánico y elasticidad. Inmersa en ella se encuentran los factores de crecimiento.

Tomado de: Cunningham, Leveno, Bloom, Hauth, Rouse, Spong. Implantación embriogénesis y desarrollo placentario. En: Williams Obstetricia. 23ª ed. México: McGrawHill; 2011. 33-77.

• Cordón umbilical

Macroscópicamente, el cordón umbilical está compuesto por dos arterias umbilicales, una vena umbilical y el tejido conjuntivo mucoso o gelatina de Wharton¹⁰.

• Gelatina de Wharton: A su vez, este está compuesto por una matriz extracelular, compuesta por colágeno y proteoglicanos entre otras sustancias, y por células estromales¹¹.
• Células estromales: son un tipo de miofibroblastos con propiedades de células madre mesenquimales. En el cordón umbilical se pueden encontrar 4 variedades de células con capacidad proliferativa: los amnioblastos que proceden de la membrana que recubre el cordón umbilical, las células progenitoras hematopoyéticas, que proceden de la sangre de cordón umbilical, las células madre vasculares de la vena umbilical, procedentes del subendotelio y endotelio de la vena umbilical y las células madre de la gelatina de Wharton. Dentro de estas, distinguimos las células madre perivasculares, las de la zona intervascular y las de la región subamniótica¹¹.
• Vasos umbilicales:
  • Arteria umbilical: En ella podemos distinguir una capa muscular gruesa en la que se observan dos capas: una longitudinal interna y una circular externa¹².
  • Vena umbilical: Muy similar a las arterias, su capa muscular está organizada también en dos subcapas: la longitudinal interna y la circular externa¹².

Tomado de: Martín-Lacave I, San Martín MªV. Lámina 8: cordón umbilical. En: Atlas práctico de histología. 2ª ed. Madrid: Díaz de Santos; 2005.

Tomado de: Martín-Lacave I, San Martín MªV. Lámina 8: cordón umbilical. En: Atlas práctico de histología. 2ª ed. Madrid: Díaz de Santos; 2005.

Tomado de: Vico, M. Evaluación de la viabilidad y caracterización genética de células endoteliales transferidas a partir de células madre de la gelatina de Wharton [tesis doctoral]. Granada: 2009.

• Líquido amniótico

Su composición varía a lo largo de la gestación, por lo que se describe la fisiología del mismo al término de la gestación. Está compuesto fundamentalmente por agua, proteínas, aminoácidos, componentes nitrogenados no proteicos (urea, creatinina), lípidos, carbohidratos, vitaminas, enzimas, hormonas y células. Estas células proceden tanto del líquido amniótico como de las mucosas y la superficie fetal. Algunas de estas células son células madre mesenquimales¹⁴.

3. CÉLULAS TOTIPOTENCIALES VS PLURIPOTENCIALES. CONCEPTO Y VENTAJAS

Las células madre o céluas troncales son células indiferenciadas, autorrenovables y con capacidad de diferenciación a células progenitoras de uno o varios tipos celulares específicos. La primera célula madre se origina con la fertilización del óvulo, de forma que hasta el estado adulto se originan más células madre que, por su potencialidad y origen se clasifican en 5 categorías¹:

• Células madre totipotenciales: Es la resultante de la fecundación, es decir, el huevo o zigoto. Tiene el potencial para formar todo tipo de células.
• Células madre multipotentes: Son las que se encuentran en el blastocisto, teniendo estas la capacidad de diferenciarse hacia células del ectodermo, endodermo y mesodermo
• Células madre multipotentes: Son las células específicas de línea, es decir, que solo originan células de la línea específica a la que pertenecen (ectodermo, mesodermo o endodermo)
• Células madre oligopotentes: Son células que pueden originar dos o más líneas celulares dentro de un tejido concreto, como por ejemplo las células madre neurales.
• Células madre unipotentes: Son aquellas que solo son capaces de producir una línea celular, como por ejemplo las espermatogonias¹.

Por su origen, las células pueden clasificarse en^1,15:

• Células madre embrionarias: Son células pluripoteniciales que pueden dar origen a todas las células adultas de un organismo y que se obtienen a partir de embriones.
• Células madre fetales:   Son células que se obtienen a partir de fetos (antes del nacimiento), con mayor capacidad de diferenciación que las células madre adultas pero menor que las células madre embrionarias
• Células madre adultas: Son células que se obtienen a partir de un organismo totalmente desarrollado: un adulto, un niño, la placenta o un recién nacido. Se trata de células multipotenciales u oligopotenciales, de las que las células de médula ósea o de la placenta son ejemplos.

De totos los tejidos existentes, la placenta y sus anejos son la fuente más importante de células madre¹⁶, concretamente de células madre mesenquimales. Además posee dos de las principales características deseadas para la terapia celular: permite obtener un gran número de células y además se pueden obtener sin necesidad de utilizar procedimientos invasivos, a diferencia de lo que ocurre con las células madre mesenquimales obtenidas de la médula ósea¹⁶. Por otro lado, al tratarse de células madre adultas, el riesgo de formación de teratomas que existe con el uso de células madre embrionarias/fetales se supera. Además, debido a la baja antigenicidad de las células madre adultas, estas pueden ser usadas tanto para trasplante autólogo como alogénico, lo que supone una gran vengaja frente a las células madre adultas obtenidas de la piel, la médula ósea o de la grasa¹⁵. Además, las células madre adultas obtenidas de los anejos fetales son más jóvenes que las obtenidas de los donantes adultos, por lo que el riesgo de que estas células presenten mutaciones adquiridas es mucho más bajo que para las células madre adultas¹¹.

Como desventajas de las células madre mesenquimales obtenidas de los anejos fetales, está en estudio si las células madre mesenquimales obtenidas de los anejos fetales son diferentes en cuanto a la capacidad de proliferación, su capacidad inmunosupresora o su capacidad de diferenciación en función del compartimento celular del que provengan (membrana amniótica, gelatina de Wharton)¹⁵.

4. FUNCIONES DE LOS ANEJOS FETALES Y EXTRAPOLACIÓN A LOS TRASPLANTES.

Tanto las membranas como el cordón umbilical desempeñan papeles muy importantes durante la gestación lo que determina que presenten unas características específicas. Son estas mismas características las que los convierten en un recurso para investigar y tratar patologías. A continuación se detallan las características más importantes de cada uno de ellos.

• Membrana amniótica/coriónica:
• Regula el transporte hidroelectrolítico: Es una de los principales motivos de su uso para el tratamiento de alteraciones dermatológicas. Además, las membranas son tejidos que se encargan de regular la composición del líquido amniótico y de producir compuestos activos que, desde el punto de vista de donación, son muy importantes, tales como los factores de crecimiento y las citoquinas^6,7,8,17.
• Acción antibacteriana, antiviral y antifúngica^1,8,18: Es otro de los principales motivos de su uso, especialmente en oftalmología^6,7. Esta acción es ejercida no solo por su capacidad de actuar como barrera biológica, si no también por la producción de múltiples sustancias que ejercen esta función.

La capacidad que tiene la membrana para adherirse a la superficie del tejido en el que se implanta explica en parte esta acción ya que reduce el depósito bacteriano. Por otra parte, el contenido en colágeno de la misma facilita que la fibrina producida por el tejido se adhiera a este, creando una matriz que facilita que las bacterias se queden atrapadas y además facilitando la migración de fagocitos.

Entre las sustancias antibacterianas nos encontramos las defensinas^6,7,19, sustancias producidas por las células epiteliales y los leucocitos que pertenecen al sistema inmune innato. También encontramos los proteínas que contienen el dominio acídico de Whey^7,19 (WAP) entre los que se encuentran, el inhibidor  de proteasas secretado por leucocitos y la elafina, sustancias con  capacidad antiinflamatoria y antibacteriana⁶. Por último, parece que la membrana amniótica también contiene interferón⁸.

• Acción antiinflamatoria^5,20: El mecanismo concreto por el que se produce se desconoce, aunque hay varias teorías para explicarla: la membrana amniótica actúa como una barrera que reduce los mediadores inflamatorios y limita la zona de inflamación a la zona afectada. Otra teoría indica que los linfocitos T son atrapados por la membra impidiendo su actuación¹⁸. Otros autores indican que las células epiteliales de la membrana secretan factores que inhiben la respuesta inmune innata y también la adquirida, además de secretar otros factores antiinflamatorios como la interleucina 10^6,17,19 y lactoferrina¹⁹.
• Escasa inmunogenicidad: Parece que las membranas amnióticas y el resto de tejidos derivados del trofoblasto son tejidos antigénicamente inmaduros (prácticamente no expresan antígenos HLA, solo HLA IB) y por tanto difícilmente generan rechazo en el trasplantado^6,7,8,17. Estos tejidos han sido utilizados en pacientes sin inmunosupresión y también en voluntarios sin observar reacción inmune alguna. Parece que además hay otros 4 mecanismos que promueven esta situación: Unión al péptido HLA-G a receptores inhibitorios presentes en macrófagos y NK, unión a través de su péptido líder al HLA-E que a su vez inhibe las NK, inhibe la proliferación de los linfocitos T CD4 e induce la apoptosis de las células T CD8¹.
• Promueve la reepitelización^1,21: Otra importante característica de las membranas y la fundamental para su uso en oftalmología. Esta capacidad está mediada por la sustancia fundamental presente en la membrana basal^6,7, que permite la migración celular y facilita la adhesión de las células¹⁸. Además, en ella se encuentran presentes factores de crecimiento e inhibidores tisulares de las metaloproteinasas, sustancias con efecto antiinflamatorio y antiangiogénico⁶, por lo que el dolor del paciente disminuye^18,5.
• Promueve la migración celular: El mecanismo se desconoce⁶.
• Promueve/detiene la angiogénesis: La capacidad de la membrana en este aspecto es controvertida, de forma que existen estudios que relatan ambas situaciones. La angiogénesis es necesaria en patologías tales como la isquemia cardiaca, la isquemia cerebral o en la curación de heridas. Sin embargo, la angiogénesis es perjudicial en patologías como el cáncer, las retinopatías, en la artritis reumatoide… Hay estudios que indican que la membrana amniótica produce sustancias anti-angiogénicas como trombospondina-1, endostatina y proteoglicanos heparán-sulfato. Otros estudios señalan que la membrana contiene sustancias angiogénicas como el factor de crecimiento endotelial vascular, interleucina 8, angiogenina o factor de crecimiento fibroblástico básico entre otros. Sin embargo, un estudio del año 2013²² demuestra que el efecto angiogénico/antiangiogénico depende del lado de la membrana que se aplique, de forma que las propiedades antiangiogénicas dependen de la zona epitelial, mientras que las propiedades angiogénicas dependen de la zona mesenquimal.
• Promueve la apoptosis de las células inflamatorias¹⁷: Se ha demostrado que las células epiteliales de la membrana amniótica disminuyen la viabilidad de las células inflamatorias y realza la apoptosis de las células inflamatorias⁵.
• Inhibe la fibrosis: Esto es debido a que inhiben los receptores TFG-β de los fibroblastos, disminuyendo por tanto la fibrosis^6,18.
• Carece de capacidad tumorogénica^1,18: Se ha probado el uso de la membrana en ratones con inmunodeficiencia servera, no observándose evidencias de formación de tumor, como tampoco ha ocurrido en voluntarios ni en pacientes que padeciendo enfermedades lisosomales recibieron terapia con las células epiteliales de la membrana¹.

En cuanto al lado de la membrana que debe aplicarse, este dependerá de las propiedades que se busquen²³: Si lo que se desea es utilizarla para soporte de cultivo celular o para facilitar la migración celular se debe aplicar el lado de la membrana basal. Si lo que se desea es utilizar la membrana como apósito o para reducir la inflamación, se debe aplicar el lado epitelial.

• Matriz extracelular de la gelatina Wharton:
  • Capacidad para soportar la compresión, la torsión  y evitar el sangrado de los vasos umbilicales²⁴: esta capacidad es ejercida por los glucosamínglucanos que contiene la gelatina de Wharton, que son capaces de entrecruzarse entre sí, lo que genera estructuras con estas características²⁵.
  • Elevada concentración de factores de crecimiento²⁵: Los factores de crecimiento presentes en la gelatina de Wharton permiten regular la actividad celular mediante la unión a receptores específicos, de los que algunos se encuentran en los glucosamínglucanos que componen la gelatina de Wharton.
  • Gran capacidad de hidratación²⁵: Esta capacidad viene determinada por la gran cantidad de matriz que posee la gelatina de Wharton y a la capacidad de esta para retener moléculas de agua.
  • Inducen migración celular²⁶
• Vasos umbilicales
  • Fuerza²⁷
  • Flexibilidad²⁷
  • Fácil obtención²⁷
  • Obtención de venas de longitud variable²⁷
• Células madre perivasculares de los vasos umbilicales:
  • Células jóvenes: Al igual que en el caso de las células madre mesenquimales, son células jóvenes de las que se espera que apenas tengan mutaciones somáticas¹¹.
  • Diferenciación hacia miofibroblastos: Este tipo de células tienen capacidad para diferenciarse hacia miofibroblastos y de producir redes vasculares estables in vitro con permeabilidad²⁸.
• Células madre mesenquimales:
• Pluripotencialidad: Las células madre mesenquimales obtenidas de los anejos fetales son células pluripotenciales que pueden diferenciarse hacia diferentes tipos celulares de tejidos como son: cartílago, hueso, tendón, ligamento, tejido adiposo, tejido conectivo²⁹, tejido hepático, tejido cardiaco, tejido pancreático o células neurales³⁰.
• Células jóvenes: Son células muy jóvenes de las que se espera que apenas tengan mutaciones somáticas, a diferencia de las células madre somáticas obtenidas de la grasa o de la médula ósea¹¹.
• Inmadurez inmunológica:  Son células inmaduras desde el punto de vista inmunológico, lo que permite que los criterios de tipaje de HLA en donante y receptor sean menos restrictivos, lo que comporta una ventaja a la hora de trasplantarlas¹¹.
• Facilidad de obtención: una vez que se ha producido el nacimiento, la placenta, las membranas y el cordón umbilical son desechados como residuos biológicos^1,2,18,24. Por otra parte, aunque la recomendación generalmente es la obtención mediante cesárea, ello no supone ningún daño adicional a la madre o al feto ^1,18,24, lo que supone una gran ventaja frente a la obtención de las células madre adultas de médula ósea o de tejido graso, en las que el donante debe someterse a un procedimiento quirúrgico para su obtención²⁴.

5. HISTORIA DEL USO DE LOS ANEJOS FETALES

• Membrana amniótica

El primer intento de usar la membrana amniótica como trasplante fue en el año 1910 como sustituto de la piel en una herida abierta^6,31,32, de forma que dos años después fue tratado con membrana amniótica el primer gran quemado. A partir de entonces se ampliaron sus usos a úlceras, pero entendido este trasplante com una situación de emergencia dado que se creía que podía producir rechazo. En los años 40 se utiliza por primera vez la membrana para la reconstrucción de superficie ocular, aunque hasta el año 1995 en que Kim y Tseng reintroducen el trasplante de membrana amniótica preservada para el tratamiento de la patología de superficie ocular, no se vuelve a retomar su uso en oftalmología^6,32. Durante los años 60 y hasta finales de siglo, se continuaron usando las membranas para úlceras diabéticas, dehiscencias de heridas posquirúrgicas o postraumáticas. Sin embargo, debido a la dificultad para conservar y procesar la membrana, así como para transportarla han dificultado su aplicación. En el año 2006 se desarrollaron los pirmeros métodos para limpiar, preparar y deshidratar la membrana amniótica para uso quirúrgico, lo que permite un fácil almacenamiento y la conservación durante 5 años, lo que ha permitido su uso no sólo en oftalmología, si no también a otras especialidades³³.

• Cordón umbilical

El cordón umbilical fue descrito por primera vez por Thomas Wharton en 1656³⁴. Sin embargo, el primer uso del cordón umbilical para trasplante no se introdujo hasta 1970, cuando se utilizaron por primera vez venas umbilicales como injerto²⁷.

El uso de la gelatina de Wharton es mucho más reciente, existiendo sólo dos artículos referentes a ella^25,26.

• Células madre mesenquimales

Más reciente es el descubrimiento de las células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton, que data del año 1991 en un estudio sobre pre-eclampsia¹¹, solo 3 años después de que se realizase el primer trasplante de sangre de cordón umbilical (1988)¹⁵. Sin embargo, la descripción de las células madre mesenquimales placentarias data del año 2004³⁰.

6. USOS ACTUALES Y POTENCIALES DE LOS ANEJOS/DERIVADOS FETALES

• Membrana amniótica: Actualmente, la membrana amniótica que se recoge en los NHS³⁵ puede ser usada para la ciertas patologías oftalmológicas así como en la cirugía corneal. Además, también puede ser usada como sustrato para cultivos celulares y para investigación (obtención de tejidos como la piel, válvulas cardiacas, tendones, vejiga o vasos sanguíneos). Por otro lado, en la literatura científica, exiten multitud de estudios acerca de los usos de la membrana amniótica, siendo las aplicaciones en oftalmología, en alteraciones dermatológicas, ginecología e ingeniería tisular las más abundantes y mejor conocidas¹⁸.

• Oftalmología: Es el uso más extendido, puesto que puede ser utilizado no solo como injerto sino como sustrato para la migración y regeneración celular. Además, se trata de un tejido avascular con propiedades antiangiogénicas, lo que constituye un aspecto fundamental en la reconstrucción de la superfice corneal¹⁸.

La membrana amniótica es utilizada en la reconstrucción de superficie ocular en patologías tales como la cirugía de pterigion y pinguécula, tumores conjuntivales, simblefaron, problemas de la esclera, quemaduras químicas o térmicas, queratoconjuntivitis, escleritis, Síndrome de Stevens-Jhonson. También es utilizada en la reconstrucción de la superficie corneal en caso de defectos epiteliales persistentes, úlceras, deficiencia total/parcial de células limbales, queratopatía bullosa, queropatía en banda. Así mismo, también es usada en la cirugía de glaucoma (trabeculectomía, recubrimiento del drenaje) y tras la queratectomía fototerapéutica, en el estrabismo, en casos de anoftalmia y también en la tenoplastia^{1,5,6,7,18,20,36,37}. Sin embargo, la evidencia científica disponible señala que podría no ser efectiva en todas las patologías descritas. Una revisión bibliográfica del año 2009³⁸ indica que el número de estudios randomizados es escaso, y que en el caso del glaucoma el uso de la membrana amniótica no supone ninguna diferencia frente al no uso. Lo mismo describe para el tratamiento de las ampollas de la trabeculectomía. De hecho, una revisión Cochrane del año 2012³⁹ concluye que no es posible concluir qué técnica quirúrgica es la más recomendable para esta patología y que sólo hay un ensayo clínico que compare la eficacia de dos técnicas quirúrgicas. En el caso de las quemaduras con sustancias alcalinas, el estudio de 2009³⁸ concluye que no se observa mejoría en la capacidad visual pero que reduce el dolor agudo y aumenta la tasa de epitelización en quemaduras moderadas, no así en las severas. Sin embargo, una revisión Cochrane del año 2012⁴⁰ señala que la evidencia sobre el uso de la membrana amniótica para el tratamiento de las quemaduras oculares agudas es insuficiente debido a la falta de uniformidad existente entre los estudios en cuanto a los criterios de éxito/fracaso, la variedad en las formas de presentación, las variaciones en el tratamiento entre otros factores. Parece que sí existe evidencia de que el uso de la membrana amniótica en el simblefaron y en la reconstrucción del fórnix resulta efectiva³⁸.

• Dermatología/cirugía plástica: Otro de los grandes usos de la membrana amniótica es para este fín, siendo sus características antiadheisvas, la acción bacteriostática, la reducción de los niveles de dolor, la capacidad de inducir epitelización y la protección de la superficie dañada los principales motivos que justifican su uso para este fin¹⁸. Una de las aplicaciones más extendidas es el uso en quemaduras, al igual que para el tratamiento de úlceras de la extremidad inferior, úlceras de decúbito y úlceras de difícil curación. Otro uso menos extendido es la protección de zonas que han sufrido traumatismos con exposición de huesos, nervios, tendones y vasos en la que no es posible un cierre inmediato por posible contaminación^{7,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55}.
• Ginecología: En este caso, se utiliza la membrana amniótica debido a su capacidad para promover la epitelización de forma rápida sin necesidad de aplicar un autoinjerto⁴⁷. La literatura disponible indica que la membrana amniótica parece resultar útil para el tratamiento del Síndrome de Asherman¹⁸, así como en la cirugía de reconstrucción o atresia vaginal, y también en casos de mastectomía radical⁷. También hay estudios publicados relativos al uso de la membrana en la reconstrucción de vagina y cérvix en mujeres con agenesia de los mismos⁵⁶, uno de ellos desarrollado en el hospital Txagorritxu⁵⁷.
• Ingeniería tisular: Su uso para este fín está basado en que la membrana amniótica es un tejido que se puede obtener fácilmente y ser usado con fines específicos, con un bajo riesgo de reacciones inmunes e inflamatorias, además de ser una estructura que promueve la migración y la adhesión celular¹⁸. Para este fín se ha utilizado la membrana amniótica como sustrato para el cultivo de melanocitos para el tratamiento del vitíligo⁵⁸, para cultivo de células de mucosa oral usadas en cirugía de cavidad oral⁵⁹, para cultivo de células utoteliales^60,61, queratinocitos, condrocitos y células endoteliales de los vasos umbilicales⁴⁷. Por otro lado, el uso de la membrana amniótica también permite mejorar la supervivencia de los colgajos incrementando la vascularización y reduciendo la proliferación de neutrófilos⁴⁷.
• Cirugía general: La mayoría de los estudios se realizan en animales, aunque se ha demostrado que es útil su uso en la anatomosis intestinal tras la resección^7,62,63 incluso cuando se administra quimioterapia⁶⁴, en la prevención de las adherencias peritoneales^7,65,66, en la gastroquisis⁷, en la cirugía de reconstrucción esofágica⁶⁷, como recubrimiento de las mallas intraperitoneales⁶⁸ e incluso como sustituta del pericardio⁶⁹.
• Endocrinología: El uso de la membrana amniótica con este fin tiene como objetivo actuar como inmunoaislante en el transplante de células de los islotes de Langerhäns para evitar o reducir el rechazo⁷.
• Tratamiento de errores congénitos del metabolismo: El transplante de membrana amniótica ha sido útil en el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick en un caso, aunque fueron necesarios trasplantes sucesivos para mantener estable la enfermedad⁷.
• Cirugía ortopédica: Hay estudios que demuestran su uso en la artoplastia de cadera y en la artritis tuberculosa⁷. Se ha desrito su uso también en el síndrome del túnel del tarso⁷⁰, en la queilectomía de hallux rigidus⁷¹, en la hemilaminectomía⁷², en la cirugía del manguito de los rotadores⁷³, en la buninectomía⁷⁴.
• Otorrinolaringología: En este caso, la membrana amniótica se utiliza como apósito en la cirugía auricular, así como en vestibulopatías⁷. Tmabién se ha descrito su uso en las timpanoplastias como sustituto de los injertos de fascia que se emplean para la fascia del músculo temporal⁷⁵.
• Odontología: Se ha descrito el uso de membrana amniótica para tratar la recisión gingival de Miller tipo I⁷⁶.
• Urología: Se está investigando su uso para la reconstrucción de vejiga⁷.
• Neurología: Las aplicaciones en este campo son posibles ya que la membrana amniótica es un medio neurotrófico⁴⁷. En estudios de experimentación se ha observado que la membrana amniótica favorece la regeneración neuronal y el crecimiento de las fibras nerviosas, lo que podría suponer en el futuro un adyuvante para la reparación del sistema nervioso central⁷. Por otro lado, en animales se ha demostrado que la membrana amniótica puede ser útil en el tratamiento del mielomeningocele⁷⁷ así como para la reparación de defectos de la duramadre en la cirugía de base de cráneo⁴⁷. Por otro lado, también resulta útil el uso de la membrana amniótica para reducir las adhesiones y mejorar la recuperación funcional de los nervios en cirugía de la mano y de la pierna. También se ha utilizado la membrana amniótica como técnica para evitar la sutura en la reparación nerviosa, encontrándose una mejoría funcional e histológica⁴⁷. Se ha usado también en la cirugía del nervio ulnar⁷⁸ y en la prostatectomía para la preservación del haz neurovascular⁷⁹.
• Cáncer: Su uso en este campo es experimental. Su aplicación se basa en las propiedades antiangiogénicas, pro-apoptóticas e inmunomodulatorias que la membrana posee, de forma que aplicada de forma local en la zona del tumor esta actuaría como una barrera impidiendo el paso de nutrientes y oxígeno al tumor, impidiendo así la angiogéneis, el crecimiento y la aparición de metástasis¹⁸.
• Matriz extracelular de la gelatina de Wharton: En cuanto a los usos de este tejido, solo está disponible la información proporcionada por una patente²⁵ y un artículo publicado recientemente²⁶. Según la patente, el biomaterial tiene dos presentaciones: inyectable y material sólido. En su versión inyectable, la matriz puede ser utilizada como matriz celular para posterior trasplante, para enfermedades articulares, tratamientos estéticos, como analgésico y antiinflamatorio. En su forma sólida sus usos son fundamentalmente cutáneos: tratamiento de quemaduras, úlceras y defectos dermo-epidérmicos, enfermedades oftalmológicas, reparación del cartílago, enfermedades osteoarticulares (defectos osteocondrales, osteoartritis, defectos óseos), como adyuvante en enfermedades vaginales, tratamiento de la gingivitis y la periodontitis²⁵. Según un artículo publicado en 2015²⁶ la matriz sólida creada por la combinación de glucosamínglucanos obtenidos del cordón umbilical permite la migración y la proliferación celular así como la producción de proteínas de la matriz extracelular. Es por ello que señala que, al menos, podría ser útil su uso para la piel y el cartílago.
• Vasos umbilicales: Los vasos umbilicales que se recogen son utilizados como sustitutos de los vasos del paciente cuando no es posible obtener una vena autóloga para el transplante^35,80. Un estudio²⁷ evaluó la eficacia del injerto de vena umbilical en 1275, concluyendo que es eficaz para la revascularización de la extremidad inferior. Sin embargo, una revisión del año 2010⁸¹ indica que para la revascularización en la isquemia crítica, es aceptable el uso de la vena autóloga, mientras que la eficacia del uso de la vena umbilical es incierto. Esta misma conclusión fue obtenida en una revisión Cochrane posterior⁸² que señala que, para el bypass femoropoplíteo, si no es posible usar una vena autóloga es preferible usar un dispositivo sintético (Dacron) frente a otros dispositivos sintéticos y a la vena umbilical. Un artículo de 2014⁸³ señala que el uso de la vena umbilical es efectiva para el tratamiento de la isquemia de la pierna.

Durante las dos últimas décadas, el uso de la vena umbilical se está ensayando para la reconstrucción vascular periférica en la que se requieren vasos de pequeño calibre⁸⁰.

Por otro lado, el uso de la arteria umbilical está menos extendido. Un estudio⁸⁴ evaluó la eficacia de las mismas para su uso como injerto vascular de pequeño diámetro, concluyendo que podrían usarse para este propósito.

• Células madre perivasculares de los vasos umbilicales: El uso de este tipo de células es experimental y solo se están llevando a cabo experimentos en animales. Los objetivos con los que se ha descrito el uso de este tipo de células son: uso como coadyuvante en el diseño de vacunas contra el cancer debido la tropismo que manifiestas las células madre mesenquimales por las células tumorales, siendo estas utilizadas como vehículos de la terapia tumoral⁸⁵. Algunos ejemplos son el uso en el hepatocarcinoma⁸⁶ , en el cáncer de próstata⁸⁷, en el glioblastoma⁸⁸.Otro de los usos que se investiga es la regeneración miocárdica tras un infarto^89,90,91.
• Células madre mesenquimales: Las células madre mesenquimales pueden ser obtenidas tanto de la membrana amniótica⁴⁷ como de la gelatina de Wharton⁸⁵ y el líquido amniótico⁹². Las aplicaciones que se han descrito para las células madre mesenquimales son:
• Tratamiento del cáncer: Se ha descrito el uso de este tipo de células para el tratamiento tanto del tumor in situ como de las metástasis^24,85, gracias a la capacidad que tienen estas células para secretar sustancias que inhiben el crecimiento celular o que provocan la apoptosis. También se ha propuesto que esta actividad está mediada por la acción inmune de estas células. Por otro lado, debido la tropismo que manifiestas las células madre mesenquimales por las células tumorales, estas pueden ser usadas potencialmente como vehículos de la terapia tumoral⁸⁵. Se ha ensayado su uso en el cáncer de pulmón²⁴ y en el cáncer de ovario⁹³.
• Enfermedades hepáticas: Las células mesenquimales tiene capacidad para diferenciarse en hepatocitos, por lo que pueden suponer un gran recurso en medicina regenerativa. Se ha estudiado su uso con éxito en animales de experimentación para la lobectomía hepática, así como para la cirrosis⁸⁵. También se ha utilizado en modelos animales para el tratamiento de la hipercolesterolemia familiar, en la fibrosis hepática¹.
• Enfermerdades pancreáticas: Se ha observado que las células madre mesenquimales se pueden diferenciar hacia células productoras de insulina, observándose en los animales trasplantados una reducción significativa de los niveles de glucemia¹. Un estudio del año 2014⁹⁴ relata el trasplante de células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton para tratar la diabetes mellitus tipo II mediante inyección de estas por vía intravenosa e intrapancreática. Concluyeron que el trasplante redujo significativamente los niveles de glucosa, hemoglobina glucosilada entre otros parámetros sin encontrarse ningún efecto adverso.
• Enfermedades pulmonares: Se ha observado que la administración en modelos con fibrosis pulmonar reduce la severidad de la misma al reducir la infiltración de los neutrófilos en la zona¹. También se ha observado que en el daño pulmonar ocasionado por la inmunodeficiencia severa combinada se producia migración celular y producción de proteínas surfactantes A,B,C y D¹.
• Enfermedades cardiovasculares: El objetivo en este campo es la producción in vitro de tejidos autólogos que regeneren el miocardio siendo la oxitocina el agente que más contribuye a su diferenciación. Hay múltiples estudios en animales, ensayándose con éxito el transplante de válvulas tricúspides generadas con células mesenquimales de la gelatina de Wharton, así como matrices de este tejido para su uso en infarto de miocardio como método para reparar o disminuir el daño producido^{24 85,95,96}. En estudios realizados con ratas, se ha observado que el injerto de células mesenquimales incrementa la fracción de eyección tras un infarto, mantieniéndose el efecto durante más de 25 semanas^1,24. Un estudio del año 2015⁹⁷ ha sido el primero realizado en 10 humanos para el tratamiento tras infarto agudo de miocardio tras cirugía de reperfusión.
• Enfermedades neurológicas: En animales de experimentación se ha ensayado la diferenciación hacia células dopaminérgicas con capacidad de síntesis para el tratamiento del párkinson²⁴. También se ha observado en un modelo animal con obstrucción de la arteria cerebral media que la administración de céluas madre mesenquimales inducía una reducción del tamaño de la zona infartada, con mejora de la disfunción conductual con respecto a los controles¹. Se ha estudiado también el efecto de estas células tras el ictus, observándose que estas ejercen un efecto neuroprotector en la fase aguda y ejercen un papel neuroprogenitor en las fases tardías^1,98,99. En este caso, las céluas se administraron por vía periférica, de forma que estas migraron al cerebro gracias a la liberación de mediadores inflamatorios (factor 1) en la zona de daño¹. También existen estudios en modelos animales en los que el uso de células madre mitiga los daños producidos por impactos de bala a nivel cerebral^100,101, así como estudios en los que su uso mejora los defectos neuronales congénitos y la esclerosis lateral amiotrófica¹⁰².
• Enfermedades auditivas: Se ha estudiado la diferenciación de estas células hacia fibrocitos cocleares para tratar la pérdida de audición¹.
• Enfermedades renales: El uso de células madre mesenquimales ha demostrado ser efectivo para revertir el daño renal agudo o crónico. En animales de experimentación su uso ha demostrado que en el daño renal agudo se reduce la inflamación, mejora la función renal y revierte la fibrosis renal¹⁰³.
• Enfermedades inflamatorias y autoinmunes: Se ha propuesto que, por sus propiedades inmunomodulatorias, las células madre mesenquimales podrían ser usadas para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal, la esclerosis múltiple¹⁰⁴, la artritis o la enfermedad injerto vs huésped¹. Además, en el caso de los pulmones se ha observado que estimulan la proliferación celular¹⁰⁵.
• Enfermedades oculares: Hay un estudio¹⁰⁶ que ha demostrado la diferenciación de este tipo de células para la regeneración de defectos de córnea, indicando además que pueden ser una alternativa para la obtención de células para el tratamiento de la deficiencia de células madre límbicas. Por otra parte, las células madre contenidas en el líquido amniótica han sido utilizadas para estimular la re-epitelización en ratones, aumentar la regeneración nerviosa del as queratectomías y como agente bacteriostático⁹².
• Regeneración del cartílago: El uso en este campo se basa en el hecho de que el tejido cartilaginoso tiene escasa regeneración y autorreparación, por lo que la terapia con células madre supone un recurso para el tratamiento en casos de traumatismo o de procesos autoinmunes¹⁰⁷. Las células mesenquimales tienen la capacidad de diferenciarse en condrocitos y osteocitos, por lo que podrían usarse en el futuro para tratar enfermedades articulares, en la osteoartritis o en la artritis reumatoide^1,24.
• Reparación de nervios periféricos: El uso de las células mesenquimales se ha centrado en la diferenciación de las células mesenquimales hacia células de la glía. Hay estudios que informan de la diferenciación hacia células de Schwann, fundamentales para la reconstrucción nerviosa incluso cuando los nervios son generados con conductos artificiales. Se ha descrito la recuperación axonal y funcional del nervio ciático tras seccionarlo en ratas^24,85. Además, la diferenciación hacia células de Shwann también permite la recuperación funcional de la médula espinal^1,24 , encontrándose mejoría funcional también en monos¹.
• Alteraciones del sistema músculo-esquelético: Se ha ensayado la diferenciación de estas células hacia miocitos, observándose que la administración en la pared abdominal  de la rata antes de realizar una laparotomía reduce la pérdida de fuerza asociada a la técnica, mejorando también la cicatrización¹.
• Reparación de la piel: Un estudio del año 2014³⁴ ha ensayado en un modelo animal el trasplante combinado de células madre mesenquimales junto con membrana amniótica para el tratamiento de una herida abierta. Tras el trasplante se ha observado no solo la capacidad de diferenciación hacia células dérmicas y la reparación de la piel, si no también la capacidad para producir pelo. También se ha documentado el uso de estas células para producir piel y mucosa oral^106,108, así como para promover la curación de las heridas^109,110.
• Expansión de células de sangre de cordón umbilical: Estudios con ratones han demostrado que el co-trasplante de la unidad de sangre de cordón umbilical junto con las células madre mesenquimales obtenidas de la gelatina de Wharton incrementa la eficiencia del injerto^24,111.
• Enfermedad injerto contra huésped: El uso de células madre mesenquimales es efectivo para el tratamiento de esta patología cuando el uso de los glucocorticoides no es efectivo¹¹².
• Diferenciación hacia células germinales: Se ha documentado la diferenciación de estas células hacia células germinales masculinas¹¹³.

7. PRODUCTOS DERIVADOS DE LOS ANEJOS FETALES

Existen en el mercado múltiples productos derivados fundamentalmente de la membrana amniótica y de la gelatina de Wharton. Algunos de ellos son:

• Prokera^5,114: Se trata de un dispositivo que contiene membrana amniótica criopreservada y cuyos usos son la protección y tratamiento de patologías de superficie ocular. Está compuesto por dos anillos flexibles entre los que se encuentra la membrana amniótica.
• AmnioGraft^5,114: Se trata de un apósito compuesto por membrana amniótica criopreservada que, al igual que en el caso anterior, se utiliza para la protección ocular y el tratamiento de patología de superfice ocular.
• AmnioGuard^5,114: Se trata de una variación de AmnioGraft, del que se diferencia en su espesor (300-400 micras frente a las 50-100 de AmnioGraft). Está especialmente diseñado para la cirugía del glaucoma, usándose como apósito para cubrir la derivación de humor acuoso.
• AcelaGraft^5,115: Se trata de un apósito que contiene membrana amniótica descelularizada y deshidratada y cuyo uso es el tratamiento de úlceras agudas y crónicas.
• UCX¹¹⁶: Se trata de una técnica de aislamiento de MSC del cordón umbilical que tiene por objetivo transformarse en un producto comercializable para poder realizar estudios comparativos acerca de la eficacia del uso de estas células.
• AmnioFix^5,117: Se trata de un apósito obtenido a partir de membrana amniótica deshidratada que tiene dos presentaciones: como lámina o como apósito envolvente. Puede ser utilizado en cirugía, heridas y en reparación de tendones y nervios.
• EpiFix^5,116,118: Al igual que el anterior, se trata de un apósito obtenido a partir de membrana amniótica y coriónica deshidratadas y cuyo uso es para el tratamiento de heridas crónicas y agudas. Debido a los variados tamaños de presentación (el mayor de 49 cm²) hace que sea especialmente recomendado como sustituto del injerto de piel.
• Neox¹¹⁹: Se trata de un producto obtenido por criopreservación de la membrana amniótica y el cordón umbilical cuya indicación es el tratamiento de úlceras y heridas de la piel.
• Clarix¹²⁰: Se trata de un producto obtenido, al igual que el anterior, a partir de la membrana amniótica y el cordón umbilical. En este caso, la indicación es cubrir heridas quirúrgicas o ser usado como barrera protectora.
• Wharton Gel Complex¹²¹: Se trata de un producto que está compuesto por glucosaminglucanos, hácido hialurónico y sulfato de condroitina y que se ha comercializado con uso cosmético (Endocare®), obtenido a partir de la gelatina de Wharton de cordones umbilicales de animales.
• Ambiodry2¹²²: Se trata de un apósito compuesto de membrana amniótica diseñado para la cirugía de superficie ocular, que presenta como ventaja que no se conserva  sobre un sustrato de nitrocelulosa.
• Ambio5¹²³: Al igual que el anterior, se trata de un apósito diseñado para la cirugía de superficie ocular que presenta como ventaja ser más fino que el anterior.
• AmbioDisk¹²⁴: Al igual que los dos anteriores, se trata de un apósito diseñado para la cirugía de superficie ocular que presenta como ventaja con respecto a los anteriores que no es necesario dar puntos de sutura, además de existir dos presentaciones con grosores distintos.
• BioXclude¹²⁵: Se trata de un apósito obtenido a partir de la membrana amniótica y el corion para la cirugía dental y periodontológica.

8. RECOGIDA DE LOS ANEJOS. SELECCIÓN DE LOS DONANTES Y PROCEDIMIENTO.

En todos los casos debe contarse con el consentimiento informado de la donante^{6, 20,35,94,126,127}.

• Criterios de exclusión

En cuanto a los requisitos que debe de reunir la donante de anejos fetales, nos encontramos con un conjunto de criterios de exclusión: ^{6,20,21,35,37,126,128,}

• Embarazo no controlado
• Patología obstétrica
• Presencia de síntomas de infección en el neonato
• Fiebre materna superior a 38ºC
• Gestación inferior a 34 semanas
• Bolsa rota
• Portadora de enfermedades infecciosas (VIH, hepatitis B o C, HTLV-1 o 2, CMV, sífilis)
• Gestación resultado de ovodonación o donación de esperma.
• Adicionalmente, en los criterios de exclusión, los NHS³⁵ incluyen como criterios de exclusión enfermedades maternas previas como cáncer, parkinson, esclerosis múltiple o la enfermedad inflamatoria intestinal.

Por otra parte, se han obervado variaciones importantes en la composición bioquímica de la membrana amniótica, fundamentalmente, en la concentración de proteínas y factores de crecimiento, de forma que estos disminuyen con el incremento de la edad gestacional y la edad materna¹²⁹. Por otra parte, también se han observado variaciones en la concentración de citoquinas entre las donantes afroamericanas y caucásicas, así como variación en los factores de crecimiento en función de la zona de la que se recoja la membrana amniótica⁴⁷. Es por ello que parece razonable que en el futuro se añadan la edad materna y la edad gestacional como criterios de inclusión/exclusión para la donación, así como criterios de selección específicos para cada situación clínica.

• Obtención

Salvo en el caso del líquido amniótico, la obtención de los anejos fetales puede realizarse tras un parto vaginal o tras un parto por cesárea²⁰. En función del anejo a utilizar y del propósito con el que este se utilice el método de recogida puede variar:

• Membrana amniótica: Si el propósito es con fines de investigación, ambas pueden obtenerse de partos por vía vaginal. Sin embargo, si el propósito es el uso como injerto, según un estudio del año 2001¹³⁰, la recomendación es que estos deberían obtenerse exclusivamente de los partos por cesárea debido al alto riesgo de contaminación con bacterias patógenas. Es por ello que la mayoría de la literatura científica emplea placenta/amnios de donantes con parto por cesárea^{6,20,21,32,35,37,47,126,130}.
• Cordón umbilical: No hay estudios acerca del método óptimo de recogida de la gelatina de Wharton o sus células, encontrándose que la mayoría de los estudios revisados utilizan la gelatina de cordones obtenidos mediante cesárea ^{11,34,108,131}. Algunos estudios no indican el método de obtención de los cordones ^94,95. En el caso de Reino Unido, los cordones umbilicales son recogidos mediante cesárea³⁵.
• Vasos umbilicales: Según un estudio del año 2008¹³² se recomienda utilizar los vasos de cordones obtenidos mediante cesárea puesto que además de poder ser procesados de forma estéril, presentan mejores propiedades antitrombóticas y vasoconstrictoras. El protocolo de recogida de membrana amniótica y cordón umbilical de Reino Unido³⁵ también establece la cesárea como método de obtención de los vasos sanguíneos.
• Líquido amniótico: La obtención del líquido amniótico se realiza mediante amniocentesis, generalmente en el 2º trimestre durante los screening prenatales o cuando se desea una interrupción voluntaria del embarazo, aunque hay un estudio reciente que ha estudiado la obtención de líquido amniótico en el 3º trimestre de gestación¹²⁷.

9. PROCESAMIENTO.

Una vez obtenidos los anejos, los métodos de transporte hasta el laboratorio y de procesamiento varían en función del anejo que se se desee procesar.

Transporte al laboratorio

• Membrana: Existen distintos procedimientos acerca del procesamiento de estas:

• Envío al banco inmersas en una solución de transporte, generalmente una combinación de antibióticos, a una temperatura de entre 2 y 10ºC ^126,128. Se puede esperar hasta 72 horas para su procesamiento completo¹²⁶.
• Envío al banco con la placenta y la membrana sumergidas en solución fisiológica a  una temperatura de entre 2 y 10ºC^20,32, con un tiempo máximo de envío de 24 horas⁶.

• Gelatina de Wharton: Independientemente de si su uso es la obtención de células o la obtención de la matriz extracelular, los cordones se conservan en un medio específico (solución balanceada de Hanks) a una temperatura entre 2 y 10ºC antes del transporte al laboratorio ^{11 ,26,103,133}
• Vasos de cordón umbilical: Existen también distintos procedimientos para el procesamiento de estos:

• Una vez que se ha producido el alumbramiento, el cordón umbilical es conservado a una teperatura de entre 2 y 10ºC, con un tiempo máximo de transporte al laboratorio de 24 horas⁸⁴.
• Conservación en un medio específico junto con una combinación de antibióticos¹³⁰.

• Líquido amniótico: Una vez realizada la amniocentesis, el LA se conserva en el mismo medio de extracción y la muestra se conserva a temperatura ambiente.

Procesamiento

• Membrana amniótica: Si no se ha utilizado una solución de transporte, la membrana es lavada con solución salina balanceada estéril (penicilina, estreptomicina, neomicina y anfotericina B) bajo una campana de flujo laminar^20,21. Si la membrana ha sido transportada en una solución específica, esta se incuba en ella entre 1 y 6 horas a una temperatura de 4ºC¹²⁸. Después de esto, en ambos casos, la membrana amniótica es separada del corion y seccionada en fragmentos de distintos tamaños^20,128. Si el uso es para la cura de las heridas, además se procede a la desepitelización de la misma mediante raspado o exposición a químicos⁴⁷. En general, si el uso es el oftalmológico se corta en fragmentos de 4 x 4 cm, en el caso de las quemaduras puede conserve entera o en fragmentos de tamaño variable (10 x 10 cm o 8 x 8 cm)^32,126. Después de esto, los fragmentos son colocados sobre papel de nitrocelulosa, con la membrana basal hacia arriba y posteriormente almacenados²⁰.
• Células madre mesenquimales de la membrana amniótica¹³⁴: Una vez procesada, la membrana se corta en fragmentos y se procede a la digestión enzimática de los mismos con colagenasa. Posteriormente se centrifuga la disolción obtenida obteniéndose así las células deseadas.
• Células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton^15,135: Existen dos métodos de extracción de las células¹⁵: El método de explante y mediante digestión enzimática. En ambos casos, el cordón umbilical es desprovisto de los vasos umbilicales y de todos los restos que pueda contener¹³⁵. En el caso del método enzimático^15,135 se procede a la digestión enzimática del mismo mediante el uso de una enzima (colagenasa) o varias enzimas combinadas (colagenasa, hialurodinasa, tripsina, dispasa II). Posteriormente, la solución obtenida se filtra para obtener la suspensión celular. En el caso del método de explante¹⁵, los fragmentos de cordón umbilical se cultivan durante un periodo de tiempo comprendido entre 2 y 4 semanas, cambiando el medio de cultivo cada 3-7 días. Este último método no permite obtener tantas células como el método enzimático¹⁵.
• Matriz extracelular de la gelatina de Wharton²⁵: Actualmente la literatura científica acerca del uso de la matriz extracelular de la gelatina de Wharton es escasa. En este caso se describe la obtención de los glucosamínglucanos presentes en él para su uso como apósito  y medio de cultivo celular. Una vez obtenido el cordón en el laboratorio, se corta en fragmentos de 1-2 cm, liberándose la sangre retenida en los vasos sanguíneos. Posteriormente se elimina la membrana amniótica y los vasos que puedan contener, obteniéndose así la gelatina de Wharton. Después, esta gelatina se sumerge en la solución de extracción (que contiene entre otras sustancias cisteína y papaína) durante 24-48 horas a 60ºC para proceder a su completa digestión. Una vez realizada se centrifuga para eliminar los residuos y se transfiere el sobrenadante a otro recipiente para obtener los glucosamínglucanos al reducirlos con etanol. Posteriormente, se deja secando a temperatura ambiente hsta la completa evaporación del etanol y se diluye de nuevo en agua pura, de forma que se pueden conservar indefinidamente a 4ºC.
• Vasos umbilicales^84,132: Si no se ha utilizado una solución de transporte, una vez en el laboratorio se disecciona el cordón longitudinalmente para obtener los vasos de unos 20-30 cm de longitud. Posteriormente se almacenan en solución salina con penicilina y estreptomicina a una temperatura entre 4-8ºC, se cortan en fragmentos de unos 5 cm de longitud y se descelularizan.

Si se ha utilizado un medio de transporte, se procede a diseccionar, descCelularizar y conservar los vasos.

• Células madre perivasculares de los vasos umbilicales¹⁵: Una vez extraídas del cordón umbilical las arterias y la vena, estos se disponen en bucles y se procede a obtener las células mediante digestión enzimática durante el tiempo necesario para separarlas de la zona perivascular. Las células desprendidas son posteriormente cultivadas como células madre perivasculares.
• Líquido amniótico¹³⁶: Tras su llegada al laboratorio, el líquido amniótico se lava con una solución específica y se suspenden las células en un medio de cultivo a una temperatura de 37ºC y bajo atmósfera de CO₂, recambiándose el medio de cultivo 3 veces por semana.

10. CONSERVACIÓN.

Independientemente del tipo de tejido/célula de que se trate, es necesaria la conservación debido a dos razones fundamentales: la necesidad de conservarlo para un futuro trasplante y asegurar la seguridad del proceso. Aunque mínimo, existe riesgo de que el tejido esté infectado a pesar de que las pruebas serológicas hayan sido negativas. Esto se debe a que es posible que en el momento en el que se realiza el análisis serológico, la donante se encuentre en el periodo ventana que se produce entre la infección y la seroconversión de la enfermedad ^{6,137,31,138,139,140}. Es por ello que se recomienda que el almacenamiento se realice durante un periodo mínimo de 6 meses antes de proceder al transplante, momento en el que se volverá a determinar el estado serológico de la donante ^35,92,129.

• Membrana amniótica: Existen diferentes métodos de conservación de la membrana^31,47,141 y no hay estandarización en cuanto a la forma de procesarla⁴⁷. Entre los métodos de procesamiento nos encontramos fundamentalmente la liofilización y la criopreservación^31,47, y aunque existen otros métodos, estos son menos aceptados⁴⁷. De todas ellas, la más ampliamente utilizada es la criopreservación a -80ºC usando como criopreservante el glicerol o el dimetil-sulfóxido (DMSO) ^{6,20,32,37,47,128}. La liofilización es un método que permite conservar la membrana amniótica a temperatura ambiente, sin necesidad de congelarla, aunque requiere esterilización con radiación gamma. Presenta como ventaja el hecho de no necesitar ser congelada, por lo que resulta más barata y más accesible y fácilmente almaccenable. Sin embargo, presenta como desventaja la pérdida de la arquitectura de la membrana y el descenso en el nivel de factores de crecimiento⁴⁷. Este método es el empleado para las presentaciones cormerciales y para cirugías no oftalmológicas, siendo escasa esta forma de conservación para el fin oftalmológico debdio al adelgazamiento de la membrana y la disolución del colágeno que sufren en el procesamiento ^6,92,142. Un estudio del año 2013¹³⁹ compara las propiedades antibacterianas de la membrana liofilizada y la membrana criopreservada, concluyendo que en ambos casos se habían reducido las sustancias antibacterianas (fundamentalmente la elafina) pero que esta propiedad se sigue manteniendo a expensas de otros componentes (células y sustancias de la matriz extracelular).
• Células madre mesenquimales/perivasculares: Independientemente del tejido del que se extraigan, las técnicas que se pueden utilizar para conservar este tipo de células son la criopreservación y la vitrificación. La criopreservación requiere de un criopreservante, de foram que puede utilizarse el DMSO solo o combinado con otros criopreservantes como el glicerol, la prolina o suero humano/animal. Sin embargo, se ha documentado que el trasplante de células criopreservadas con DMSO produce efectos secundarios como fallo cardiaco, distrés respiratorio, hipotensión, bradicardia, parada respiratoria y arritmias mortales. A pesar de que existen protocolos para eliminar el DMSO, se han notificado reacciones adversas tras su uso. Es por ello que se están buscando alternativas al uso del DMSO y al suero animal como criopreservantes. Otro método que se puede utilizar para conservar estas células es la vitrificación. Es por ello que se continúa investigándose acerca del método a utilizar, siendo múltiples las investigaciones en este sentido^{96,139,143,144,145}.
• Matriz extracelular de la gelatina de Wharton²⁵: Como ya se ha dicho anteriormente, una vez obtenidos los GAG de la gelatina, estos pueden ser conservados a 4ºC de forma indefinida. Además, se puede obtener solidificada mediante liofilizacion
• Vasos umbilicales⁸⁰: Los métodos descritos para la conservación de los vasos son la criopreservación, almacenamiento en frío o la conservación en gluraldehído. La criopreservación  puede ser usada tanto para las arterias y las venas, siendo utilizado generalmente el DMSO como criopreservante. En el caso del almacenamiento en frío, este sólo se ha utilizado en venas umbilicales. Consiste en conservar las venas a 4ºC en una solución con antibióticos. En el caso de la conservación con glutaraldehído, este ha sido usado en la conservación de la vena umbilical.
• Líquido amniótico: Un estudio de este año¹⁴⁶ demostró que de los 7 protocolos de criopreservación que usó para conservar las células, concluyó que 3 de ellos eran efectivos. Uno de ellos usó un 10% de DMSO como criopreservante, otro etilenglicol, sacarosa y Ficoll 70 y el último usó solución para congelación lenta.

11. DONACIONES REALIZADAS. CENTROS AUTORIZADOS PARA RECOGIDA Y CONSERVACIÓN.

En cuanto al número de donaciones realizadas a nivel nacional sólo hay datos disponibles acerca de la placenta y de la membrana amniótica. Los últimos datos disponibles (2015) indican que en nuestro país se realizaron 76 donaciones, con un total de 1551 tejidos trasplantados. Este número de donaciones sólo es superado por Francia e Italia, con 110 y 242 donaciones respectivamente¹⁴⁷.

En lo que se refiere a los centros autorizados para la recogida de placenta a nivel nacional encontramos que Andalucía, Aragón, Comunidad Foral de Navarra, Canarias, Castilla y León, Castilla-La Mancha, Cataluña, Comunidad Valenciana, Extremadura, Galicia, Madrid y País Vasco tienen al menos un centro autorizado para la obtención de membrana amniótica. En lo que se refiere a la obtención de tejido de cordón umbilical, únicamente están autorizados algunos centros de la Comunidad de Madrid¹⁴⁸.

En cuanto al implante, Andalucía, Aragón, Comunidad Foral de Navarra, Canarias, Cantabria, Castilla y León, Castilla-La Mancha, Cataluña, Ceuta, Comunidad Valenciana, Extremadura, Galicia, Islas Baleares, La Rioja, Madrid, País Vasco, Principado de Asturias y la Región de Murcia tienen al menos un centro acreditado para realizar el implante de membrana amniótica. Para el tejido de cordón umbilical no hay ningún centro a nivel nacional autorizado para realizar el implante¹⁴⁸.

En lo que se refiere a los centros autorizados para la conservación de membrana amniótica, encontramos que Andalucía, Comunidad Foral de Navarra, Canarias, Cantabria, Cataluña, Extremadura, Galicia, Islas Baleares, Madrid, País Vasco y Principado de Asturias disponen de al menos un banco autorizado para este fin. Para el tejido de cordón umbilical sólo hay autorizados dos bancos en Madrid¹⁴⁸.